viernes, 1 de abril de 2011

Uso del ADN de los animales en la genética forense



El análisis del material genético de diferentes especies, especialmente el ADN de los animales, está siendo cada vez más empleado por los investigadores forenses a nivel mundial.

En este artículo, el ADN de animales se refiere al ADN de aquellos seres vivos del reino Animalia (animales), que constituye un amplio grupo de organismos eucariotas, heterótrofos, pluricelulares y tisulares que se caracterizan por su capacidad para la locomoción, por la ausencia de clorofila y de pared en sus células. Animalia es uno de los cinco reinos de la naturaleza, y a él pertenece el ser humano.

La investigación del ADN de los animales puede ser de interés en el ámbito legal debido a: el comercio y la posesión de una especie o productos derivados de esta, que son penados por la ley, como prueba de un delito cometido en contra una persona o propiedad; investigación del maltrato o crueldad animal, o casos de abigeato. En el primer caso, se trata de determinar la especie presente, y los otros escenarios pueden ser abordados mediante la comparación del perfil del ADN proveniente de una evidencia biológica no humana (animal) en particular, con otro perfil que se obtenga de alguna evidencia biológica que se localice en el sitio del suceso y se sospeche tenga la misma fuente de origen.

Identificación de las especies:
Los marcadores más comúnmente utilizados para identificar animales son el Citocromo b (citocromo b) y y el Citocromo C Oxidasa I (COI) . El proceso de identificación de las especies es igual para cualquiera de estos genes, una sección del marcador del gen en estudio se amplifica y luego es directamente secuenciado. El gen del citocromo b resulta ser más conveniente en la identificación taxonómica de las especies.

Actualmente se está llevando a cabo la identificación de muchas especies de vertebrados como: los tiburones, serpientes y tortugas marinas , así como también, se ha logrado aislar ADN de los cuernos del rinoceronte y los dientes de marfil del elefante y los tigres. La secuenciación de una porción de 600 pares de bases del gen que codifica para la producción del COI se ha propuesto como un medio para crear un catalogo de la biodiversidad de especies que existen en la tierra3, y ya se ha utilizado ampliamente en invertebrados , y peces , , .

En los casos donde se requiere la diferenciación de especies estrechamente relacionadas, el uso de una secuencia llamada D-loop del ADN mitocondrial puede ser apropiado 1, , , , . En lo que respecta a la identificación humana el uso de esta sección del ADN mitocondrial ya ha sido ampliamente utilizada , , .

El uso de un marcador genético único no puede producir altos niveles de confianza en la identificación taxonómica de especies, y en cuanto al uso del ADN mitocondrial es preciso señalar que los híbridos sólo comparten información con la donante materna. Numerosos marcadores genéticos secuenciados de muchas especies de animales se pueden encontrar disponibles en varias bases de datos, como GenBank (www.ncbi.nih.gov), EMBL European Molecular Biology Laboratory, Nucleotide Sequence Data base (www.embl.ac.uk) y BOLD Barcode of Life Data Systems (http://www.boldsystems.org/views/login.php). Por mencionar las más populares.
Individualización de especies:

Las repeticiones cortas en Tándem (STR) son la herramienta más usada en la individualización de especies. En la actualidad han sido desarrolladas las bases de datos de las frecuencias de muchos alelos STR para una serie de poblaciones de mamíferos, en especial algunas especies domésticas, como por ejemplo perros , , , , gatos , , caballos , , , vacas , y palomas . Para los animales silvestres, son pocas las bases de datos disponibles, como por ejemplo: ciervos ; jabalíes , tigres , el tejón europeo Meles meles , las aves de rapiña como el águila real Aquila chrysaetos, y especies como el halcón Falco cherrug , y serpientes de cascabel Crotalus tigris . Cabe señalar que estas bases de datos pueden usarse para el estudio de una población de una especie en particular y pueden, o no, ser relevantes para otros análisis intraespecíficos.

La ISFG junto con EDNAP, ENFSI y el SWGD son organizaciones que han desarrollado líneas de investigación para la elaboración de guías y el establecimiento de una nomenclatura generalizada en los procesos relacionados con la identificación genética de la especie humana , sin embargo este no es el caso en la investigación del ADN de animales con fines forenses. Existen muy pocas publicaciones que toman en cuenta la normalización y validación de los métodos de identificación e individualización de especies no humanas mediante el estudio de su ADN .

La toma de muestras:
La recogida y manipulación de las muestras requiere el empleo de las mismas normas aplicadas en la investigación de cualquier hecho delictivo. La integridad de las muestras y la trazabilidad de la prueba requieren la misma atención para garantizar que el caso fue investigado de la manera correcta.
Recomendación # 1: Los mismos procedimientos que se emplean para garantizar la integridad y la trazabilidad de las muestras en cualquier investigación criminalística deben ser empleados en la recogida y examen de las muestras tomadas de animales.

Muestras de ADN utilizados en los estudios de validación:
En los estudios de validación es fundamental que la muestra indubitada provenga de una fuente confiable, los ejemplares se pueden obtener de los zoológicos, si no están disponibles las muestras, la autenticación de la especie puede realizarse a través de la secuenciación de un marcador genético, como por ejemplo, el Citocromo b o el COI y la comparación de las secuencias puede llevarse a cabo utilizando una base de datos como la GenBank. Debe tenerse en cuenta que para cualquier informe subsecuente, GenBank no está regulada y la información generada a partir del estudio comparativo de la secuencia obtenida se supone es correcta.
Recomendación # 2: Para los estudios de validación de especies no domesticadas se deben usar muestras de especímenes clasificados y/o plenamente identificados. Si esto no es posible, entonces, debe hacerse una nueva investigación dependiendo del tipo de muestra utilizada.


Especies de prueba:
Un gran número de primers universales se han publicado como útiles en la identificación genética de diferentes taxones. La localización de los primers dentro del genoma debe estar registrada, especificando si estos están destinados para uso universal o solo para el estudio de determinadas especies. Cuando se utilizan primers universales, debe tomarse en consideración que existe la posibilidad de tener una mezcla con ADN de otras especies, sobre todo en rastros de animales, como por ejemplo, si hay pequeños puntos de sangre en la ropa de los humanos, con un primer universal se amplificara preferentemente el ADN humano, mientras que la secuencia de la especie cuestionada probablemente no se detecte. La posición de los primers en el genoma se registrará de acuerdo con la secuencia existente en la base de datos GenBank disponible en internet. En el caso del uso de un marcador en el ADN mitocondrial, es preferible describir la secuencia completa del genoma y designar la posición del marcador en el genoma. Cuando no se conoce una secuencia del ADN mitocondrial, se puede utilizar una o varias secuencias de referencia para establecer la posición. La confusión puede producirse si se utiliza una nomenclatura diferente, por lo que es necesario un acuerdo sobre la nomenclatura en una etapa temprana. Las secuencias de ADN mitocondrial D-loop para caninos ya han sido ampliamente investigada y sirve de modelo para futuras investigaciones.

Hay que demostrar la especificidad del marcador de la especie objeto de investigación utilizando información foránea, ya sea por referencia de artículos publicados o trabajos de laboratorios. También deben ser consideradas todas las especies similares genéticamente a la especie en cuestión.

El tamaño esperado de un amplicón debe registrarse. Este debe ser comparado con lo observado y cualquier discrepancia debe tomarse en cuenta.

El grado de homología con miembros de la misma especie debe registrarse junto con cualquier variación intraespecífica y el número de muestras utilizadas en cualquier estudio dentro de una especie. Puede ser que la secuencia del ADN presentada en el GenBank no sea representativa de la especie, lo que debe tenerse en cuenta para cualquier estudio adicional.

Es preferible una mayor diferencia en las secuencias genéticas en la investigación de especies y debe ser reportado cualquier dato que supone la variación dentro de una especie o entre especies. Estos estudios pueden conducir a conclusiones exactas donde los resultados revelan la presencia de material biológico proveniente de un individuo de una especie, aunque los resultados también pueden revelar la presencia de un individuo de una especie diferente.

Recomendación # 3: La elección del marcador para la identificación de especies, como el citocromo b, COI, y la región D-loop, debe justificarse en base a la capacidad que ellos tienen de identificar especies desconocidas entre parientes genéticos.

Recomendación # 4: La secuencia de nucleótidos y el mapa con la ubicación del marcador usado para el estudio de la especie de interés debe estar disponible en algún artículo publicado anteriormente.

Recomendación # 5: Deben realizarse estudios intraespecíficos e inetrespecificos para cualquier primer nuevo que se utilice en la identificación de especies. El proceso llevado a cabo para validar las pruebas deberá incluir estudios sobre la sensibilidad, especificidad, reproducibilidad y el comportamiento del marcador al analizar muestras mezcladas.

Diseño de los Primers:
Los marcadores más utilizados para la identificación de especies son los que utilizan series de repeticiones cortas en tándem (STR), este marcador debe ser comparado con los ya existentes en las bases de datos de libre acceso. También es requerida la demostración de la especificidad sobre la especie, género ó familia y deben ser documentados experimentos de reactividad cruzada. Un número de muestras del mismo origen y otras que estén bajo investigación, deben ser examinadas para asegurar la reproducibilidad, hay que tener en cuenta todas las variables al ser analizadas las muestras.

Debe ser proporcionado el protocolo utilizado con la finalidad optimizar la investigación con una amplificación múltiplex. El examen de un gran número de muestras también es necesario para detectar cualquier ambigüedad creada por las mutaciones. Si es posible, los primers deben ser secuenciados y las secuencias deben hacerse públicas. Los marcadores utilizados para identificar caninos y felinos se han desarrollado a base del estudio de secuencias STR, ver: en los sitios: www.cstl.nist.gov/div831/strbase/), (http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/dogSTRs.htm) y (http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/catSTRs.htm).
Recomendación # 6: Los primers utilizados para amplificar el ADN polimórfico deben ser probados para asegurar su especificidad y reproducibilidad, y deberán publicarse bajo un dominio público disponible en internet.

Nomenclatura de los alelos STR:
Los alelos obtenidos a partir de cualquier estudio del ADN repetitivo deben ser reportados, lo que está en conformidad con un estudio previo de los STR de perros y a continuación deben seguirse las directrices elaboradas por la ISFG . Para aquellos involucrados con la identificación genética en casos forenses, existe una familiaridad con las series de repeticiones donde se analizan cuatro nucleótidos, aunque también puede darse el caso del estudio de series de repeticiones de dos nucleótidos en humanos.

El equilibrio entre heterocigotos debe ser reportado para cada marcador probado. En el caso de repeticiones de dinucleótidos, los heterocigotos separados por un alelo deben registrarse para demostrar cómo se segregan los alelos.

Recomendación # 7: Si se usan marcadores basados en repeticiones polimórficas para la individualización de especies, las series de repeticiones cortas en tándem serán preferidas.

Escaleras alélicas para los marcadores STR:
El desarrollo de una escalera alélica es la herramienta ideal para asignar los alelos obtenidos después de la secuenciación del ADN extraído de las muestras dubitadas e indubitadas. Se requiere un estudio exhaustivo de los marcadores empleados para generar una escalera alélica adecuada, de tal manera que la mayoría de los alelos obtenidos luego de la secuenciación de los marcadores escogidos para identificar las muestras caerán dentro de un alelo conocido.

Tiene que ser utilizada una muestra de genotipo conocido, llamada control, para confirmar que los diferentes alelos estudiados por separado dan la respuesta esperada. Si una especie es el foco de estudio, entonces el ADN control por defecto debería ser identificado en base al método reportado por Szibor et al. . La escalera alélica tendrá que ser analizada varias veces, dependiendo del medio de separación utilizado para la secuenciación, con el fin de detectar la variación electroforética. Esto permitirá obtener un número de pares de base (pb) que proporcionará la posición con respecto a otros alelos según la escalera alelica y permitirá asignar valores a los alelos desconocidos visualmente o mediante la adopción de programas informáticos pertinentes. El uso de una escalera alélica permitirá la asignación de alelos STR en función del número de veces que se repite un segmento de interés del ADN, expresado en el número de pares de bases.

Recomendación # 8: La secuenciación de escaleras alélicas es esencial para la asignación exacta de los alelos y se puede utilizar en el estudio de los STR. El número de repeticiones debe ser la base de todos los de resultados en los informes, más que utilizar el tamaño en función del número de pares de bases de cualquier muestra analizada.

Mutaciones en STR:
Si la tipificación de las STR se utiliza para establecer las relaciones entre familias y/o especies como parte de una investigación forense, se espera que exista conciencia de la posibilidad de que existan mutaciones en la evaluación de los resultados. Cuando se observa una incompatibilidad genética, existe una probabilidad de mutación, y deberían estudiarse según las recomendaciones de Gjertson et al. .

Ejemplos de este tipo incluyen la comparación del ADN de especímenes criados en cautiverio o capturados en el medio silvestre. Las probabilidades de mutaciones en los marcadores seleccionados pueden ser establecidas por estudios en un grupo, como las familias. Estos parámetros tienen un valor especial en los casos de inconsistencias genéticas aisladas o juntas con un cociente de probabilidad relativamente alto. Estos resultados se pueden obtener en situaciones donde existe una relación genética estrecha entre dos especies, o cuando han ocurrido mutaciones.

Recomendación # 9: Las probabilidades de mutación de los alelos STR se debe estimar si los encuentra, o al menos la probabilidad de una mutación del evento que ocurre se debe considerar cuando hay incompatibilidad genética en un locus único o pocos, mientras los demás loci muestran consistencia genética.
Base de datos de la frecuencia de alelos:

Un número razonable de muestras deben ser procesadas con el fin de estimar la frecuencia con que se repiten los alelos dentro de una población. Los individuos recolectados deben ser representativos de la población en estudio. Suficientes muestras deben recogerse de tal manera que sea posible dar cuenta de cualquier error de muestreo . A menudo se usan 200 individuos que son representativos de una población54, aunque el tamaño de las muestras depende del número de contribuyentes potenciales y la diversidad del marcador. Las frecuencias obtenidas en las bases de datos deben ser examinadas mediante el estudio del equilibrio Hardy-Weinberg y se debe tomar nota de cualquier desviación.

Recomendación # 10: Deben ser estimados los diferentes parámetros genéticos incluyendo las frecuencias alelicas.
Efectos de parentesco:

Un factor que afecta la probabilidad de que dos miembros de una misma población compartan un alelo, ya que tienen un antepasado genético común se utiliza comúnmente en comparaciones de los perfiles del ADN humano para la resolución de casos forenses. Este factor de parentesco, a menudo es llamado FST o , por lo general va desde 0,01 hasta 0,03 en los seres humanos y se aplica muy a menudo. La magnitud de la cifra utilizada indica el grado estimado de parentesco con un ancestro común. En las grandes poblaciones humanas, el grado de ascendencia común suele ser pequeño, pero este puede no ser el caso en poblaciones de especies no-humanas, en particular en pequeñas poblaciones aisladas de animales silvestres, en las especies domesticadas, no hay mucha dispersión, porque casi no existe la poligamia. Este factor ha sido estudiado para las criaturas salvajes, como el ciervo, el oso y el tejón europeo, y han sido publicados indicando el grado de consanguinidad en las poblaciones silvestres relacionadas con la especie.

Recomendación # 11: Un factor de parentesco exacto debe calcularse y aplicarse para cada población siempre que sea posible. La importancia y el uso de la estadística en una serie de poblaciones animales y humanas ha sido revisada recientemente .
Notificación de los resultados:

El formato de los informes dependerá del laboratorio y en los casos penales se debe orientar por las disposiciones referidas en el artículo 239 del Código Orgánico Procesal Penal. Es importante que cualquier informe instruya claramente la afirmación que se trate en él. Debe ser proporcionada la base científica de la prueba en el informe. Los resultados obtenidos en casos cerrados deben ser reportados. Los resultados deben basarse en la información dentro de un expediente que debe ser integral, incluyendo todo el material recopilado y producido como parte del análisis. El expediente debe ser objeto de revisión por un experto si así lo amerita.

El dictamen pericial debe ser claro, y ofrecer todas las alternativas creíbles para explicar la situación, la relación de verosimilitud debe estar avalada por estudios internacionales publicados en revistas y revisados por laboratorios pares. Si esto no es posible, los datos pertinentes deben estar disponibles a cualquier experto.

Recomendación # 12: Un archivo completo debe ser mantenido. La relación de verosimilitud es una forma de valorar la prueba.
Acreditación de los laboratorios que trabajan con el ADN no humano (con fines forenses)

Los laboratorios que tienen por objeto llevar a cabo pruebas de rutina deben considerar la acreditación, siguiendo como modelo la norma ISO 17025, como se recomienda por la ISFG . Esta recomendación está especialmente dirigida a los laboratorios donde se practican los análisis de ADN con fines forenses en forma rutinaria.

Recomendación # 13: Se debe buscar la acreditación del laboratorio y la certificación de los procesos y el personal si las pruebas de ADN en animales para un fin determinado se convierten en rutina.

En el año 2006, en el laboratorio Criminalístico del Cuerpo de Investigaciones Científicas Penales y Criminalísticas (C.I.C.P.C.), Delegación Estadal Aragua, se practicó el análisis y comparación de los apéndices pilosos (pelos) de un perro llamado Boby, propiedad de uno de los sospechosos del secuestro y homicidio del empresario ítalo-venezolano Filippo Sindoni. Según Hernández y Sapienza (2006), la experticia practicada a los pelos de Boby arrojo como resultado “una correspondencia con los pelos encontrados en la boca e indumentaria que vestía el industrial cuando fue hallado sin vida el día 29 de marzo del año 2.006”. Sin embargo, la experticia tricologíca y el análisis físico-comparativo de los pelos de Boby sólo pueden llegar a señalar que los pelos pertenecen a un perro de su misma raza, sin afirmar que los mismos son de él. En este contexto, la Individualización mediante el análisis del ADN de los pelos de Boby habría jugado un papel fundamental. Es importante que existiendo la tecnología que permite la individualización de especies no humanas, busquemos la manera de incorporarla al proceso penal venezolano, esto puede significar el aporte de nuevos elementos objetivos que ayuden a incriminar o exculpar a los sospechosos de cometer un delito, con esto también se puede disuadir a la población de cometer actos delictivos y se le puede ofrecer a la misma más confianza en la justicia.

Actualmente la Licenciada Iris Catherine Carma, se encuentra trabajando en un proyecto que pretende aportar un protocolo de trabajo que ayude al investigador criminalista a individualizar los apéndices pilosos de los perros domésticos (Canis familiaris) aplicando diferentes técnicas de biología molecular.